Summary

Introduction: Clostridium difficile (C. difficile) is the most commonly identified causative agent of antibiotic-associated diarrhea. Since immunosuppression is a significant risk factor in febrile neutropenic patients who complain of diarrhea, investigation of toxin A/B is recommended. In this study we aimed at investigating the frequency of C. difficile toxin A or B in stools of patients with malignancies who developed diarrhea during the febrile neutropenic period and to analyze the epidemiological characteristics of toxin-positive patients.

Materials and Methods: We analyzed stool samples of patients who were admitted to our hospital. These patients either had hematological malignancies or solid organ tumors and they had developed diarrhea during the febrile neutropenic period. The frequency of C. difficile toxin A and B was identified with chromatographic immunoassay method by using a commercial kit (MonlabTest, Spain) that allowed for qualitative identification of C. difficile toxins A and B at the same time.

Results: From January 1, 2012 to August 15, 2015, 197 stool samples were analyzed. C. difficile toxin A+B positivity was identified in 9 samples (4.6%), Ascaris eggs were detected in 14 samples (7%) and Salmonella spp. were found in one sample. The mean age of the toxin-positive patients (6 female, 3 male) was 63.5 years; seven had hematological malignancies (78%) and two had solid organ tumors (22%). All the cases had a history of multiple antibiotic treatments. Seven patients had a history of quinolone prophylaxis, two patients had a history of intensive care admission and all the patients had long-term hospitalization with a mean length of 46 days hospitalization.

Conclusion: In febrile neutropenic patients with diarrhea, the rate of C. difficile toxin A+B positivity was 4.6%. Having a history of chemotherapy, quinolone prophylaxis, carbapenem use, long-term hospitalization, and use of multiple antimicrobials were found to be common epidemiological characteristics.

Introduction

C. difficile enfeksiyonu tanısı amacıyla antijen aranması, kültür, sitotoksisite testleri ve polimeraz zincir reaksiyonu kullanılmaktadır. Kesin tanı, dışkıdan C. difficile’nin üretilmesi ve hücre kültüründe sitopatik etkiyi saptayarak toksin yapımının gösterilmesi ile konur[7]. Ancak rutinde bu her zaman mümkün olmadığından toksin saptamaya yönelik testlerle daha hızlı tanı konabilmektedir, bu amaçla ELİSA (enzyme-linked immunosorbent assay) ve lateks aglütinasyon testleri rutin pratikte sıklıkla kullanılmaktadır.

Biz de çalışmamızda kemoterapi sonrası nötropeniye giren ve ishal gelişen hematolojik maligniteli ve solid organ tümörlü hastalarımızda toksin A ve B pozitifliği oranlarının kılavuzların dikkat çektiği gibi yüksek olup olmadığını araştırmayı ve C. difficile tanısı öncesi öngörü sağlayabilmek için pozitiflik saptanan hastaların ortak özelliklerini, febril nötropeni, malignite ve kemoterapiye ilaveten hangi riskli özellikleri taşıdıklarını araştırmayı amaçladık.

Methods

Testin Prensibi
İnsan dışkı örneklerinde toksin A ve B’nin saptanmasını sağlayan kalitatif yatay akış (İmmünolateral) immünoassay testidir. Bu kitte strip üzerinde test A ve test B membranları vardır. Test A’nın membranı toksin A’ya karşı geliştirilmiş monoklonal antikorlarla, test B’nin membranı da toksin B’ye karşı geliştirilmiş monoklonal antikorlarla kaplıdır. Test sırasında örnek karışım hazırlanır, eküvyon ile alınan dışkı örneği (yaklaşık 125 mg) 1 mL buffer içeren test tüpüne konularak karıştırılır ve hazırlanan karışımdan 4 damla alınarak test kiti üzerine damlatılır. Örnekte bulunan toksin A anti-toksin A antikorları ile, toksin B de antitoksin B antikorları ile reaksiyona girer ve karışım kapiller hareketle yukarı doğru çıkarak olumlu sonuç durumunda membranda bulunan spesifik antikor, karışımdaki konjugatla reaksiyona girerek renkli çizgiler oluşturur. Yani test monoklonal antikorlarla kaplı lateks partiküllerine toksinin tutunması esasına dayanır, 10 dakika içinde sonuçlar okunur. Olumlu sonuçlarda ilgili alanlarda kırmızı renkli çizgiler oluşur. Hastaların epidemiyolojik verilerinin değerlendirilmesi amacıyla çalışma sonrasında hastaların yaşları, cinsiyetleri, malign hastalık tanıları, kullandıkları antibiyotikler, kinolon profilaksisi alıp almadıkları, bu yatışlarında ve son bir yılda hastanede yatış süreleri, yoğun bakıma yatış öyküleri, mukozit veya graft versus host hastalığı (GVHH) varlığı, enteral beslenme, nazogastrik sonda varlığı, invazif aspergilloz ve antifungal ilaç kullanım durumları belirlenip kaydedilmiştir.

Results

Tablo 1: Hastaların demografik özellikleri

Discussion

C. difficile tanısında çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Mikroskobik incelemede dışkıda lökosit, eritrosit görülüp Gram boyamada da baskın olarak subterminal sporlu Gram-olumlu çomaklar saptanabilir, ancak tanısal değeri yoktur. Floresan mikroskobu ile C. difficile antijenlerine karşı işaretlenmiş antikorlar kullanılabilir, ancak özgüllüğü düşüktür. Selektif anaerob kültür sikloserin sefoksitin fruktoz agar besiyerinde tipik kokulu sarı koloniler görülür, kültür en duyarlı yöntemdir, ancak toksin üreten suşlara özgül olmayıp rutin uygulaması kolay değildir ve pahalıdır, ancak tiplendirme avantajı vardır ve salgınlarda epidemiyolojik araştırmaların temelini oluşturur. C. difficile tanısında altın standart hücre kültüründe toksin tayinidir, duyarlılığı ve özgüllüğü yüksektir, ancak test 3-9 gün sürer. EİA ile C. difficile glutamat dehidrogenaz saptanmasının duyarlılığı %85-95, özgüllüğü %89-99’dur. Test olumsuzsa C. difficile yoktur, olumluysa hücre kültüründe toksin konfirmasyonu ya da polimeraz zincir reaksiyonu gereklidir. EİA ile C. difficile toksin A ve B saptanması ise en sık kullanılan tanı metodu olup, duyarlılığı %75, özgüllüğü %99’dur, ucuz ve pratiktir, 1 saat içinde sonuç verir[9]. Ayrıca çalışmamızda kullandığımız metod olan immünokromatografik yöntemlerle toksin A+B bakılabilir. Monoklonal antikorlarla kaplı lateks partiküllerine toksinin tutunması esasına dayanan bu test pratik olması dolayısıyla rutin uygulamada sık olarak kullanılır, duyarlılığı %89, özgüllüğü %89 olarak bildirilmiştir[10]. Test negatif bulunduğunda eğer hastanın kliniği C. difficile kolitini yüksek oranda düşündürüyorsa daha duyarlı diğer testlere de başvurulması önerilmektedir[10]. ABD’de 2008 yılında laboratuvarda kullanılan testlerin değerlendirildiği bir araştırmada %43 oranında EİA, %40 oranında da hızlı immünokromatografik yöntemin kullanıldığı bildirilmiştir[11, 6] çalışmasında ishalli hastalarda C. difficile sıklığı ELİSA yöntemi ile %24, hematolojionkoloji ve kemik iliği nakil ünitelerinde %38 bulunmuştur. Deniz ve ark.[13] Marmara Üniversitesi Hastanesi’nde yatan, ishali olan 633 hastanın dışkı örneklerinde EİA ile toksin pozitiflik oranını %4,7 olarak bildirmişlerdir. Aygün ve ark.[14] antibiyotik ile ilişkili ishal olgularında C. difficile toksin A ve B pozitifliğini %4,3 olarak bildirmişlerdir. Büyükbaba Boral C. difficile ön tanısıyla laboratuvara gönderilen örneklerde sadece toksin A varlığını belirleyen kit ile %4,7 olarak belirlerken daha sonraki yıllarda gönderilen 400 dışkı örneğinde toksin A/B varlığını %12 olarak belirlemiştir[15]. Bu durum her iki toksini de araştıran kitlerle duyarlılığın daha da arttığını göstermektedir. Çeşitli merkezlerden bildirilen oranlar arasındaki farklılıklar, çalışmada kullanılan yöntem ve kitlerle, örneklerin saklanmasında kullanılan yöntemlerin, hasta popülasyonu ile hastaların hastanede yatış sürelerinin, antibiyotik kullanım politikalarının ve hastanelerin enfeksiyon kontrol önlemlerinin farklılığından kaynaklanıyor olabilir.

Toksin araştırılmasında hızlı sonuç alınması ve uygulama kolaylığı nedeniyle toksin A ve B’yi birlikte saptayan ELİSA yöntemi kullanılmaktadır[16]. Sadece toksin A’yı araştıran kitlerle bazı olgular gözden kaçabilmektedir, bu yüzden ikisini birden saptayan kitler daha güvenilirdir. Biz de çalışmamızda C. difficile toksin A ve B’nin aynı anda kalitatif olarak belirlenmesini sağlayan ticari kiti (MonlabTest, İspanya) kullandık. Ancak çalışmamızda kullandığımız yöntemin duyarlılığı diğer yöntemlere göre düşük olduğundan oranlarımız nispeten düşük çıkmış olabilir. Ayrıca hafif ve erken olgularda toksin saptanmıyor olabilir. Olgularımızın çoğu da mevcut risk faktörleri ve hassas immün durumları nedeniyle yakın takipte olduklarından erken dönemde örnek alınmasına bağlı olarak toksin sonuçları negatif sonuçlanmış olabilir. Vanpoucke ve ark.[10] ticari ELİSA kitlerini kültür ve kromatografik yöntem ile karşılaştırmışlar ve kromatografik yöntemin ELİSA’dan daha duyarlı olduğunu saptamışlardır. Olguların klinik bulgularıyla birlikte değerlendirilmesinin ve farklı yöntemlerle çalışılmasının gerektiğini vurgulamışlardır. Yapılan çalışmalarda antibiyotik kullanımı C. difficile ilişkili ishal için önemli bir risk faktörü olup beta-laktam grubu antibiyotik kullanımının (penisilin, sefalosporin, imipenem, meropenem) daha ön planda olduğu görülmektedir[13, 17, 18]. Bizim çalışmamızda da toksin pozitif olguların hepsi karbapenem, çoğu glikopeptid grubu antibiyotik ve hepsi çoklu antibiyotik kullanmaktaydı. C. difficile’ye bağlı ishalde en önemli risk faktörlerinden birisi de hastanede yatış süresidir. Bu sebeple C. difficile ishalinin hastane enfeksiyonu olduğu düşünülmektedir. Bir çalışmada predispozan faktör tanımlamayan 37 kişinin %10,8’inin dışkısından hastaneye yattıktan 30 gün sonra C. difficile izole edilmiştir[5]. Ayrıca enfekte hasta ile aynı odanın paylaşılması da önemli bir risk faktörüdür[19, 20]. Çalışmamıza alınan hastaların hastanede yatış süreleri uzun olup (7-90 gün) ortalama 46 gün olarak belirlendi.

C. difficile enfeksiyonlarının gelişmesinde altta yatan ciddi bir hastalığın varlığı, hastaların yaşlı olması, kanser varlığı, kemoterapi alıyor olmak diğer önemli risk faktörlerindendir[21]. Çalışmamızda toksin pozitifliği saptanan olgular risk faktörleri açısından değerlendirildiğinde hastalarımızın ikisi hariç diğerlerinin yaşlı olması, hepsinin kemoterapi almış olması ve sonrasında nötropeni gelişmesi, febril nötropeni tanısıyla interne edilip karbapenem başlanmış olmaları ortak özellikleriydi. Olguların beşinde glikopeptid kullanımı da mevcut olup hepsi çoklu antibiyotik kullanmaktaydı. Yedi olgunun kinolon profilaksisi aldığı öğrenildi. İki olgunun yoğun bakım ünitesinde yatış öyküsü ve tüm olguların daha önce uzun süreli olarak, ortalama 46 gün, hastanede yatış öyküleri mevcuttu. Ayrıca enteral beslenme toksin pozitif hastaların yaklaşık yarısında mevcuttu. Başlıca diğer risk faktörlerinden olan mukozit, GVHH varlığı, nazogastrik sonda varlığı ve invazif aspergillozis varlığı az sayıda toksin pozitif hastada bulunuyordu.

Çalışmamızdaki toksin pozitif olguların sayısının azlığı kolaylaştırıcı faktörlerin değerlendirilmesinde bir sınırlandırma oluşturmaktadır, olgu sayısı arttığında daha sağlıklı bir istatistiki değerlendirmeye olanak sağlayacaktır.

Conclusion

Etik
Etik Kurul Onayı: Hastanemizde retrospektif çalışmalarda etik kurul onayı istenmemektedir.

Yazarlık Katkıları
Konsept: Nur Efe İris, Aslıhan Demirel, Dizayn: Nur Efe İris, Reyhan Diz Küçükkaya, Veri toplama ve işleme: Nur Efe İris, Safiye Koçulu, Esin Çevik, Analiz veya Yorumlama: Nur Efe İris, Aylin Ordu, Literatür tarama: Nur Efe İris, Yazan: Nur Efe İris.

Çıkar çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangibir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Finansal destek: Çalışmamız için hiçbir kurum ya da kişiden finansal destek alınmamıştır.

References

1Bartlett JG. Historical perspectives on studies of Clostridium difficile and Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 2008;46 (suppl 1) p.4-11.

2Poxton IR, Mc Coubrey J, Blair G. The pathogenicity of Clostridium difficile. Clin Microbiol Infect. 2001;7:421-7.

3Bignardi GE. Risk Factors of Clostridium difficile infections. J Hospital Infect. 1998;40:1-15.

4Barbut F, Petit JC. Epidemiology of C. difficile associated infections. Clin Microbiol Infect. 2001;7:405-10.

5Tunçcan ÖG, Ulutan F, Karakuş R. Antibiyotiğe bağlı ishal gelişen nötropenik ve nötropenik olmayan hastalarda C. difficile toksin sıklığı ve risk faktörlerinin analizi. Mikrobiyol Bul. 2008;42:573-83.

6Freifeld GA, Bow JE, Sephowitz KA, Boechk MJ, Ito IJ, Mullen CA, Road I, Rolston KV, Young JA, Wingard JR. Clinical Practice Guideline for the Use of Antimicrobial Agents in Neutropenic Patients with Cancer: 2010 Update by the Infectious Diseases Society of America, p.56-93.

7Kostul H, Delialioğlu N, Horasan EŞ, Emekdaş G, Öztürk C, Kuyucu N. Hastanede yatan hastaların dışkı örneklerinde Clostridium difficile toksin araştırılması ve risk faktörlerinin incelenmesi. Turk Hij Den Biyol Derg. 2015;72:183-90.

8Carter GP, Road JI, Lyras D. The role of toxin A and toxin B in Clostridium difficile associated disease: past and present perspectives. Gut Microbes. 2010;1:58-64.

9Tunçcan ÖG . Clostridium difficile infeksiyonu: Epidemiyoloji, Tanı ve Tedavi. KLİMİK 2013, XVI. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi, kongre kitabı, s:102-103.

10Vanpoucke H, De Baere T, Claeys G, Vaneechoutte M, Verschraegen G. Evaluation of six commercial assays for the rapid detection of Clostridium difficile toxin and/or antigen in stool specimens. Clin Microbiol Infect. 2001;7:55-64.

11Schmidt ML, Gilligan PH. Clostridium difficile testing algorithms: what is practical and feasible? Anaerob. 2009;15:270-73.

12Lale Z, Doğruman AL, Fidan I, Adıyaman G, Yeşilyurt E, Özkan S, Çağlar K. İshalli hastaların dışkı örneklerinde Clostridium difficile toksin A ve B sıklığının araştırılması. ANKEM Derg. 2013;27:55-9.

13Deniz U, Ülger N, Aksu B, Karavuş M, Söyletir G. Marmara Üniversitesi Hastanesi’nde yatan ishalli hastalardan izole edilen Clostridium difficile kökenlerinde toksin genlerinin araştırılması. Mikrobiyol Bul. 2011;45:1-10.

14Aygün G, Aslan M, Yaşar H, Altaş K. Antibiyotik ile ilişkili ishal olgularında Clostridium difficile toksin A+B araştırılması. Türk Mikrobiyol Cem Derg. 2003;33:39-41.

15Büyükbaba Boral Ö. Clostridium difficile infeksiyonu ön tanılı hastaların dışkı örneklerinde toksin A ve B’nin belirlenme sıklığı. Turk Mikrobiyol Cem Derg. 2002;32:220-4.

16Shin BM, Kuak EY, Lee EJ, Songer JG. Algorithm combining toxin immunoassays and stool culture for diagnosis of Clostridium difficile infection. J Clin Microbiol. 2009;47:2952-6.

17Ercis S, Ergin A, Hasçelik G. Six years evaluation of Clostridium difficile associated diarrhea. Mikrobiyol Bul. 2004;38:45-50.

18Altındiş M, Usluer S, Çiftçi H, Tunç N, Çetinkaya Z, Aktepe OC. Investigation of the presence of Clostridium difficile in antibiotic associated diarrhea patients by culture and toxin detection methods. Mikrobiyol Bul. 2007;41:29-37.

19Beşirbellioğlu AB, Görenek L, Dizer U, Hacıbektaşoğolu A. GATA Eğitim Hastanesi’nde nozokomiyal C. difficile sıklığı. Hastane Enfeksiyonu Derg. 1997;1:158-62.

20Mc Farland LV, Mulligan ME, Kıvak RY, Stamm WE. Nosocomial acquisition of C. difficile infection. N Engl J Med. 1989; 320:204-10.

21Thielman MM. Antibiotic associated colitis. pp: 1249-63. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds) Mandell, Douglas and Bennett’s Principles and Practice of Inf Dis, 2005, 6th ed. Elsevier Churchill Livingstone, Philadelphia.

The Evaluation of Clostridium difficile Toxin A ve B Positivity Rates and Epidemiological Characteristics in Febrile Neutropenic Patients with Diarrhea